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简述嵌合基因的构建。

问答题
2022-05-22 23:45
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正确答案
嵌合基因的构建:
(1)从杂交瘤细胞的基因组文库中筛选功能性可变区基因:破碎杂交瘤细胞,用离心沉淀提取总的RNA、酶切以后,琼脂糖凝胶电泳分离大小为15-20kb的DNA;离心提取入噬菌体EMBL3的DNA并且制备双臂;过夜连接杂交瘤细胞的DNA和入DNA双臂,在体外包装后,感染受体均Q359,铺平板进行入噬菌斑培养;用同一酶切的肝DNA做对照,利用Southern杂交分析基因重组情况。
(2)PCR扩增VH、VL基因:设计数对简并PCR引物,用于后续的DNA合成;从杂交瘤细胞中离心提取出基因组DNA或RNA,反转录成eDNA:PCR扩增或RT-PCR扩增VH、VL基因并克隆、鉴定。
(3)嵌合基因的构建,从杂交瘤细胞株基因文库中筛选并鉴别出功能性重链和轻链的可变区基因,将它们分别置换质粒pSVl84 HneoDNSVKHIIK中的EcoRI-EcoRIII片段和HindIII片段,酶切鉴定置换片段的方向,取插入方向正确的质粒。

试题解析

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