硬脂酸的合成，在动物和植物中有所不同：
动物中，合成场所有两处，即线粒体和粗糙内质网。生成的产物为硬脂酰CoA。在线粒体中，合成硬脂酸的碳原子受体是软脂酰CoA，碳原子的供体是乙酰CoA。在内质网中，合成硬脂酸的碳原子受体是软脂酰CoA，但碳原子的供体是丙二酸单酰CoA。
植物中，合成场所是叶绿体或前质体，碳原子受体不同于动物，是软脂酰ACP，碳原子的供体也不同于动物，是丙二酸单酰ACP，生成硬脂酰ACP。
在两种生物中合成硬脂酸的还原剂都是NADPH+H+。所产生的硬脂酰CoA和硬脂酰ACP经水解，即成游离的硬脂酸。