脂肪酸合成酶系存在于肝、肾、脑、肺、乳腺和脂肪组织的线粒体外胞液中，肝是人体合成脂肪酸的主要场所，脂肪组织是储存脂肪的仓库，乙酰CoA是合成脂肪酸的主要原料，一般来自葡萄糖。脂肪酸合成酶系所催化的合成反应，不是β-氧化的逆过程。脂肪酸合成的直接产物是软脂酸，再在线粒体/微粒体内将其加工成其他种类的脂肪酸，合成过程可分为3个步骤：
（1）乙酰CoA转运出线粒体。线粒体内生成的乙酰CoA必须进入胞液才能在其合成酶催化下参加合成反应。首先乙酰CoA与草酰乙酸缩合生成柠檬酸，再穿越线粒体内膜进入胞液，裂解后重新生成乙酰CoA。释出的草酰乙酸转变成丙酮酸后重新进入线粒体，这一过程称为"柠檬酸-丙酮酸穿梭"。
（2）丙二酰CoA的合成。在乙酰CoA羧化酶的催化下，乙酰CoA被羧化成丙二酸单酰CoA，该酶属变构酶，是脂肪酸合成的限速酶。其活性受柠檬酸与异柠檬酸的变构激活，并受长链脂酰CoA的变构抑制。
（3）脂肪酸合成循环。脂肪酸合成时碳链的缩合延长是类似β-氧化逆过程的循环反应：缩合→加氢→脱水→再加氢。NADPH为供氢体，故与磷酸戊糖旁路有关。每经过一次循环反应，即延长两个碳原子。高等动物的脂肪酸合成酶系，是一条多肽链构成的多功能酶。常以二聚体存在，每个亚基都含有一个脂酰基载体蛋白（ACP）域。