影响T_m的因素主要有：
①G-C对含量。G-C对含3个氢键，A-T对含2个氢键，故G-C对相对含量愈高，T_m亦越高。在0.15mol/LNaCl，0.015mol/L柠檬酸钠溶液（1×SSC）中，经验公式为：（G+C）%=（T_m-69.3）×2.44。
②溶液的离子强度。离子强度较低的介质中，T_m较低。在纯水中，DNA在室温下即可变性。分子生物学研究工作中需核酸变性时，常采用离子强度较低的溶液。
③溶液的pH。高pH下，碱基广泛去质子而丧失形成氢键的有力，pH大于11.3时，DNA完全变性。pH低于5.0时，DNA易脱嘌呤，对单链DNA进行电泳时，常在凝胶中加入NaOH以维持变性关态。
④变性剂。甲酰胺、尿素、甲醛等可破坏氢键，妨碍碱堆积，使T_m下降。对单链DNA进行电泳时，常使用上述变性剂。