原理：抗酸杆菌的主要特点是细胞壁含有大量类脂，一般不容易着色，但经加温或延长染色时间着色后，能抵抗酸性乙醇的脱色。而非抗酸菌则不具此特征，染色后容易被盐酸酒精脱色。
方法：涂片、干燥、固定。初染：滴加苯酚复红液于涂片上，染色10分钟或蒸染5分钟后，水洗。脱色：滴加3%盐酸乙醇，脱色时频频倾动玻片，直至无明显颜色脱出为止，水冲洗。复染：滴加碱性亚甲蓝液复染1分钟后，水冲洗，干燥，显微镜观察。
结果：抗酸杆菌被染成红色，细胞及其他细菌被染成蓝色。