脊索动物门的主要特征是以下三点：
脊索：是背部起支持作用的一条棒状结构，介于消化管和神经管之间。它来源于胚胎期的原肠背壁。它由富含液泡的脊索细胞组成，外面围有结缔组织性质的脊索鞘。充满液泡的脊索细胞由于产生膨压，使整条脊索即具弹性，又有硬度，从而起到骨骼的基本作用。低等脊索动物中，脊索终生存在或仅见于幼体；高等脊索动物只在胚胎期出现，发育完全时即被分节的骨质脊柱取代。
背神经管：脊索动物神经系统的中枢部分是一条位于脊索背侧的神经管，由胚胎背中部的外胚层下陷卷褶所形成。背神经管在高等种类中前后分化为脑和脊髓；神经管腔在脑内形成脑室，在脊髓中形成中央管。
咽鳃裂：低等脊索动物在消化管的前端的咽部两侧有一系列左右成对排列、数目不等的裂孔，直接开口于体表或以一个共同的开口间接的与外界相同，这些裂孔就是咽鳃裂。在裂孔表面着生有鳃丝，故有呼吸功能。低等水栖脊索动物的咽鳃裂终生存在并着生鳃，陆栖高等脊索动物仅在胚胎期或幼体存在，成体最终消失。