首页/ 题库 / [问答题]我们实验室研究生做了一个如下的实验:将p的答案

我们实验室研究生做了一个如下的实验:将pdc基因(丙酮酸脱羧酶)克隆到pUC18载体中,以便在E.coli TOP10中表达,这个pdc基因两侧具有BamHI的位点,因此计划将它从BamHI的位点插入载体中。实验严格按分子克隆实验手册中进行:载体用BamHI切割后,立即用碱性磷酸酶处理,接着将处理过的载体同用BamHI切割的pdc基因混合,加入T4连接酶进行温育,连接后,将DNA同处理过的可以接受外源DNA的E.coli TOP10感受态细胞混合。最后将混合物涂布在加有氨苄青霉素、IPTG和x-gal固体培养基的平板上。  实验中同时设置了4个对照:  对照1:将未同任何载体接触过的细菌细胞涂布在培养平板上。 对照2:将未切割载体转化过的细菌细胞涂布在培养平板上。  对照3:将经切割(但未用碱性磷酸酶处理)并用T4连接酶连接(但没有pdc基因)的载体转化过的细菌细胞涂布在培养平板上。  对照4:将经切割(并用碱性磷酸酶处理过)并用T4连接酶连接(但没有pdc基因)的载体转化过的细菌细胞涂布在培养平板上。  在进行第一次实验时,感受态细胞不是自己制备的,结果,在所有的平板上都长出了多到无法计数的菌落(见下表1)。在第二次实验中,自己制备感受态细胞,但这一次,所有的平板上都没菌落生长(见下表1)。接着又进行了第三次实验,这次得到了转化子(见下表1)。从实验平板上挑出12个菌落,分离质粒DNA,并用BamHI进行切割,其中9个克隆产生大小同载体pUC18一样的单一的一条带,另3个克隆中切出一个pdc基因,实验终于获得成功。 第三次实验如何进行转化子的挑选?并说明其原理?

问答题
2023-03-09 22:18
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正确答案
第三次试验挑选白色菌落为重组克隆。其原理是pUC18载体LacZ’和受体菌E.coli TOP10的LacZ△M15能获得互补的β-半乳糖苷酶活性,当在IPTG的诱导下,表达LacZ’,此时获得β-半乳糖苷酶活性,从而分解加入到平板中的生色底物x-gal,此时菌落为蓝色。当外源基因插入到pUC18载体时,外源基因与LacZ’形成融合蛋白,此时不能与LacZ△M15进行互补的β-半乳糖苷酶活性,因此不能分解生色底物x-gal,此时菌落成白色。

试题解析

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